PNGase F

1: Protein Deglycosylation Using Denaturing Conditions for SDS-PAGE a.Add up to 50μg of the target glycoprotein in water (or a compatible buffer at a low ionic strength) to a final volume of 12μl.

b. Add 1μl of 5% SDS.

c. Add 1μl of 1M DTT.

d. Denature sample by heating at 95°C for 5 minutes.

e. Cool sample for 5 minutes at room temperature.

f. Add 2μl of 0.5M sodium phosphate buffer (pH 7.5). Note: Other buffers can be used if they are within the acceptable pH range for PNGase F (pH 6–10).

g. Add 2μl of 10% NP-40. Note: Triton X-100 may be substituted for NP-40. H.Add 2μl of recombinant PNGase F. I.Incubate at 37°C for 1–3 hours.

2: Protein Deglycosylation Using Non-Denaturing Conditions for Mass Spectrometry

a. Add up to 20μg of glycoprotein in 50mM ammonium bicarbonate (pH 7.8) to a final volume of 18μl.

b. Add 2μl of recombinant PNGase F.

c. Incubate at 37°C for 2–18 hours.

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